細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法

細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法

細胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片，細胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹，胞漿內形成多個(gè)膜結構尚完整的“小泡”及 “凋亡小體” (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。
       根據凋亡細胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設計了許多不同的細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
 

 鏡像綺點(diǎn)依靠多年在細胞培養方面的積累，為客戶(hù)提供完整的細胞CRO解決方案。根據客戶(hù)需求，直接在細胞水平進(jìn)行藥物或者試劑的刺激，觀(guān)察細胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動(dòng)物模型，對動(dòng)物進(jìn)行處理后，分離特定的原代細胞進(jìn)行需要的檢測。

    同時(shí)，我們可以依照客戶(hù)提供的具體實(shí)驗方案進(jìn)行操作，也可以根據客戶(hù)要求進(jìn)行實(shí)驗設計，并根據客戶(hù)實(shí)驗的規模和難度提供詳細的報價(jià)和實(shí)驗周期規劃。

       一、光學(xué)顯微鏡觀(guān)察

       凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個(gè)形式存在，凋亡細胞與周?chē)毎蛛x，不引起炎癥反應。
本方法簡(jiǎn)便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀(guān)性，重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀(guān)察，作為分析指標之一。
       檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀(guān)察凋亡細胞的形態(tài)改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。
       二、視頻時(shí)差顯微技術(shù)
       此方法用于細胞培養，通過(guò)相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀(guān)察細胞凋亡的變化過(guò)程，尤其是觀(guān)察細胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長(cháng)，出現釘狀突起，特續數小時(shí)后細胞膜破裂，細胞溶解，通過(guò)連續觀(guān)察，本方法可養壑培養中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。
       檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀(guān)察凋亡細胞的動(dòng)態(tài)改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續24小時(shí)。如同進(jìn)進(jìn)行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀(guān)察和攝影。
       三、電子顯微鏡觀(guān)察

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見(jiàn)胞膜起泡現象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結構,因此用光鏡觀(guān)察難以令人滿(mǎn)意,而透射電鏡可清楚地觀(guān)察到細胞結構在凋亡不同時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀(guān)察是迄今為止判斷凋亡經(jīng)典、可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。

       缺點(diǎn)：
       (1)只能定性,不能定量;
       (2)標本處理過(guò)程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測;
       (3)在組織切片上進(jìn)行電鏡觀(guān)察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。
       檢測方法：透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀(guān)察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀(guān)察。
       四、流式細胞技術(shù)
       流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過(guò)檢查其光射特征及熒光參數時(shí)行的。細胞穿過(guò)流式細胞儀的激光束集點(diǎn)時(shí)使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

細胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法
       細胞凋亡過(guò)程中出現的形態(tài)改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細胞主要表現為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。
       由于光散射牧場(chǎng)生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來(lái)才能準確地辨認凋亡細胞。
       細胞凋亡過(guò)程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個(gè)亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。
       根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術(shù)還可以通過(guò)測定線(xiàn)粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認凋亡細胞。
       檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。                                     

一站式細胞解決方案

    針對基礎及臨床研發(fā)中的原代細胞和iPS細胞的實(shí)驗，由于原代細胞的分離和培養難度大，iPS細胞制作和分化的實(shí)驗操作復雜，除長(cháng)期進(jìn)行原代和iPS培養工作的實(shí)驗室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細胞比較困難。

服務(wù)流程：

    1.聯(lián)系我們，溝通客戶(hù)實(shí)驗計劃及目標，評估實(shí)驗的的可行性。    

    2.依照客戶(hù)要求，設計相應的實(shí)驗；或客戶(hù)已有實(shí)驗方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性。    

    3.確定終的實(shí)驗方案，報價(jià)和周期。    

    4.簽訂服務(wù)合同，支付預付款。    

    5.開(kāi)始實(shí)驗服務(wù)，并定期向客戶(hù)反饋和交流。    

    6.實(shí)驗完成，提供完整實(shí)驗說(shuō)明和部分實(shí)驗結果。    

    7.支付尾款，向客戶(hù)提供完整的全部實(shí)驗報告和原始數據。    

    8.項目完成。

• iCell-E15190h白脂素（Asprosin）ELISA試劑盒
• iCell-012激光掃描共聚焦顯微鏡
• iCell-011細胞HE染色
• iCell-00103D細胞培養技術(shù)
• iCell-006染色體核型分析常用的方法
• iCell-005免疫組化實(shí)驗
• iCell-CRO04MTT法細胞活性檢測
• iCell-CRO03Western blot/CCK8/MTT/Transwell細胞遷移
• iCell-CRO01穩定細胞株構建/鏡像綺點(diǎn)（iCell）