MTT法細胞活性檢測

MTT檢測法，是一種檢測細胞存活和生長(cháng)增殖的方法。
檢測原理：活細胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長(cháng)（或其他波長(cháng)）處測定其光吸收值，在一定細胞數量范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)，來(lái)判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。
該方法靈敏度高、經(jīng)濟實(shí)用，已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模藥物篩選、細胞毒性試驗以及細胞放射敏感性測定等等。

MTT主要有兩個(gè)用途：（1）藥物（也包括其他處理方式如放射線(xiàn)照射）對體外培養的細胞毒性的測定；（2）細胞增殖及細胞活性測定。

MTT法細胞活性檢測

MTT方法能簡(jiǎn)單、快捷、準確地測定細胞的增殖反應，并且其價(jià)格低廉，成為日前各實(shí)驗室檢測細胞活性的shou選方法之一。其檢測原理為活細胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長(cháng)處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值）來(lái)判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。

一、MTT 溶液的配制

1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml，須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg，250mg或1g。對于100mg這樣的小包裝，廠(chǎng)家都是將MTT放入小管中的，個(gè)人建議不要再用天平稱(chēng)量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS來(lái)溶解。具體做法：預先在50ml離心管（沒(méi)有的話(huà)，可用培養瓶替代）加入20ml PBS，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻?？梢灾貜蛶状?，以使小管中的MTT不殘留于管內。將MTT*混勻后，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長(cháng)期保存于-20℃。按細胞培養板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時(shí)可考慮每管分裝1ml。對于大包裝，可按上述方法稱(chēng)取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管里，用的時(shí)候現配，直接往培養板中加。

2、注意事項：

（1）在配制和保存的過(guò)程中，容器用鋁箔紙包住。

（2）配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對菌很敏感。

（3）MTT一般現用現配，過(guò)濾后4℃避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(cháng)期保存，避免反復凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用。

（4）MTT有致癌性，使用時(shí)需小心。

MTT法細胞活性檢測

二、MTT甲瓚溶解液

1、二甲基亞砜DMSO：可以直接溶解，無(wú)需配制，使用方便，溶解速度快，但對人體毒性較大，且需去除原培養液，在去除培養液的過(guò)程中，可能會(huì )把結晶去掉，導致結果不穩定。

2、三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml，用雙蒸水溶解配成100ml溶液，該溶解液不需去除原培養基，但溶解較慢。該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。

三、MTT法實(shí)驗步驟

1、yi酶消化對數期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。

2、將細胞懸液制備好后，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。

注意：因細胞在混勻后仍要繼續沉降，因此接種的過(guò)程中要反復多次混勻，如每加6個(gè)孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對于MTT的結果至關(guān)重要。

3、將接種好的細胞培養板放入培養箱中培養，至細胞單層鋪滿(mǎn)孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁后即可加藥（兩小時(shí)——半天時(shí)間），但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設3-5個(gè)復孔，建議設6個(gè)，否則難以反應真shi情況。

注意：對于加藥，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然后將96孔板中的培養上清去掉（可以用排槍吸走）再加入100ul含不同濃度藥物的培養基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養液全部吸走后再加藥，應該吸完一部分后立即加樣，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。

4、5%CO2，37℃孵育16-48h，倒置顯微鏡下觀(guān)察藥物的作用效果。

5、每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。

6、終止培養，準備溶解結晶。

溶解結晶的方法有兩種，用DMSO溶解：

1)用DMSO溶解： MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。將上清去掉，該過(guò)程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

另一種方法，用三聯(lián)溶解液：

1) MTT加入培養4h后，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。（該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時(shí)候易產(chǎn)生結晶，因此在用之前必須提前幾小時(shí)拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用。）

2) 放入培養箱中繼續孵育4—6小時(shí)，鏡下觀(guān)察，待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時(shí)左右，紫色結晶會(huì )全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時(shí)間會(huì )短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時(shí)間會(huì )長(cháng)一些。

7、同時(shí)設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養液、MTT、二甲基亞砜）。

四、MTT結果分析

關(guān)于如何計算IC50 ——改良寇式法:lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

Xm：lg 大劑量

I：lg(大劑量/相臨劑量)

P0：陽(yáng)性反應率之和

Pm：大陽(yáng)性反應率

Pn：小陽(yáng)性反應率

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