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穩轉細胞系(穩定表達細胞株)指在細胞中持續穩定表達特定基因或干擾特定基因表達。穩轉細胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細胞染色體上,使細胞長(cháng)期穩定表達該基因。穩轉細胞株包括多克隆穩轉細胞株和單克隆穩轉細胞株。慢病毒感染目的細胞后,通過(guò)抗性基因篩選得到的細胞株是多個(gè)細胞克隆的組合。單克隆細胞株是從多克隆細胞中經(jīng)細胞克隆挑選得到的,由一個(gè)細胞擴增得到的細胞株。單克隆細胞株性狀統一,傳代過(guò)程中細胞的基因表達保持穩定。
篩選穩定細胞株的兩種方法:
1、轉染質(zhì)粒后,單克隆方法篩選穩定細胞系
對大多數細胞轉染效率較低。對于基因過(guò)表達,如果轉染效率達到40%,基因過(guò)表達尚可。但是對于基因干擾實(shí)驗,對轉染效率要求遠遠高于基因過(guò)表達,通常質(zhì)粒轉染無(wú)法滿(mǎn)足。
另外,質(zhì)粒游離于細胞質(zhì)中,很快降解,無(wú)法滿(mǎn)足較長(cháng)時(shí)間的檢測項目;質(zhì)粒轉染整合幾率極低,穩定細胞株構建耗時(shí)耗力,且得率很低,往往需要挑取單克隆株。
2、病毒感染篩選穩定細胞株
病毒感染方法較質(zhì)粒轉染篩選單克隆方法更方便和高效,是目前主流的穩定細胞系篩選方法。用慢病毒制備穩轉細胞株,由于其高效整合、高效轉錄、高效表達、宿主范圍廣,感染效率高,且與細胞染色體整合而不發(fā)生基因重排,是制備穩定細胞株的理想載體。
穩定轉染細胞株服務(wù)流程:
1、載體構建:將外源基因構建到合適的載體上,如需病毒轉染,則包裝病毒。
2、篩選濃度測定:以10-14天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
3、細胞接種:轉染實(shí)驗前天接種細胞,各種細胞的平板密度依據各種細胞的生長(cháng)率和細胞形狀而定。進(jìn)行轉染當天細胞應達到60%-80%覆蓋。
4、細胞轉染:用構建好的載體(或包裝好的病毒)轉染目的細胞。
5、抗生素篩選。
6、鑒定篩選結果。