養細胞需要注意的細節

養細胞可謂是個(gè)精細活，從事養細胞的人都知道養細胞的時(shí)候一旦不注意，就很容易造成細胞污染，所以想要養好細胞除了小心謹慎以外，還要提前做好準備：
細胞培養前的準備
1）在帶上手套開(kāi)始細胞培養之前,先檢查一下移液管和瓶子的數量是否充足,以免在開(kāi)始實(shí)驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細胞污染的風(fēng)險。
2）細胞培養基也應先預熱,選擇只預熱部分培養基而非整瓶加熱,不但可以節約實(shí)驗時(shí)間,而且可以避免因反復加熱培養基而造成的蛋白質(zhì)降解。

3）結束操作后,別忘了培養基對光敏感,應盡可能避光保存。

細胞培養的定期檢查
1）定期檢查培養細胞的形態(tài)，即形狀和外觀(guān)，對于細胞培養實(shí)驗取得成功至關(guān)重要。
2）除確認細胞的健康狀態(tài)外，每次操作細胞時(shí)通過(guò)肉眼和顯微鏡檢查細胞還可早期發(fā)現污染征象，避免污染擴散至實(shí)驗室其他細胞。
       細胞變質(zhì)的征象
1）細胞變質(zhì)的征象包括核周出現顆粒、細胞與基質(zhì)解離以及細胞質(zhì)空泡形成。
       2）這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：培養物污染、細胞系衰老或培養基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養物需要更換培養基。

       3）變質(zhì)嚴重時(shí)將會(huì )成為不可逆的變化。

       細胞培養通風(fēng)櫥的消毒及布局
       1）保持細胞培養通風(fēng)櫥內的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。
       2）向放入通風(fēng)櫥內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進(jìn)行消毒。
       3）在通風(fēng)櫥中部開(kāi)闊處放置細胞培養容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養基置于右后方便于吸??；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。
       培養瓶/皿等物品的無(wú)菌操作
       1）無(wú)菌培養瓶、試劑瓶、培養皿等物品使用時(shí)方可揭開(kāi)蓋子，不得將其開(kāi)放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時(shí)應將蓋子開(kāi)口朝下放在工作臺面上。
       2）進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)不要說(shuō)話(huà)、唱歌或吹口哨。盡快完成實(shí)驗，以盡量避免污染。
       細胞培養中可能的污染物
       1）細胞培養污染物主要分為兩類(lèi)：
        a.化學(xué)污染物,如培養基、血清和水中的雜質(zhì)、內毒素、增塑劑和去污劑。
        b.生物污染物，如細菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細胞系的交叉污染。
        c.可通過(guò)充分了解污染源以及采用良好的無(wú)菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴重程度。
        交叉污染的確認
        1)交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細胞及其他生長(cháng)迅速的細胞系間廣泛的交叉污染是個(gè)明確的問(wèn)題，會(huì )造成嚴重后果。
        2)從聲譽(yù)好的細胞庫獲取細胞系、定期檢查細胞系性質(zhì)及采用良好的無(wú)菌技術(shù)有助于避免交叉污染。
        3)通過(guò)DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認有無(wú)交叉污染。
        細胞換液注意事項
       1)為細胞換液時(shí)，要沿著(zhù)培養瓶的一側輕輕地加入，而不是直接加到細胞中，以免損傷細胞，當培養的細胞株較為脆弱時(shí)尤其需要注意。
       2)使用無(wú)菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時(shí)，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。
       細胞傳代的時(shí)間把握
       1)當細胞呈指數增殖，貼壁培養的細胞已占據所有可用基質(zhì)、沒(méi)有擴增空間，或懸浮培養的細胞已超過(guò)培養基質(zhì)所支撐的能力，無(wú)法進(jìn)一步生長(cháng)時(shí)，細胞增殖速度將大大降低甚至*停止。
       2)為了將細胞密度維持在*水平，以便細胞繼續生長(cháng)，并且刺激進(jìn)一步增殖，必須對細胞進(jìn)行傳代。
       細胞培養中使用抗生素的注意事項
      1)細胞培養時(shí)不應長(cháng)期使用抗生素，因為連續使用抗生素會(huì )促進(jìn)抗生素耐藥性細胞株的產(chǎn)生，導致輕度污染持續存在。
      2)抗生素只能作為對付污染的zui后手段短期使用，并盡快撤除。
      3)如果長(cháng)期使用抗生素，則應同時(shí)進(jìn)行無(wú)抗生素培養，以便作為鑒別隱性感染的對照。
       細胞凍存的必要性
       1)連續培養的細胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細胞系zui終會(huì )發(fā)生衰老，所有培養的細胞都易受到微生物污染，即使運轉情況的實(shí)驗室也會(huì )遇到設備故障的問(wèn)題。

       2)由于已建立的細胞系是一種寶貴資源，更換細胞系成本高昂，而且耗費時(shí)間，因此，必須將其冷凍起來(lái)，長(cháng)期保存。

細胞凍存的事項
1)應在細胞濃度高的情況下進(jìn)行細胞培養凍存，并且細胞傳代的次數盡可能少。
2)在凍存前確?；罴毎陌俜直戎辽贋?0%。請注意，*凍存條件取決于所用細胞系。
3)凍存和復蘇過(guò)程對大多數細胞都會(huì )造成不利影響，因此不要通過(guò)渦旋震蕩或者用力敲打培養瓶的方法使細胞脫落（培養昆蟲(chóng)細胞時(shí)除外），也不要高速離心細胞。
凍存培養基的選擇
1)凍存細胞時(shí)必須選擇凍存培養基，凍存培養基中應含有DMSO或者甘油等冷凍保護劑。
2)還可使用專(zhuān)門(mén)配制的*凍存培養基，例如HyClone、Gibco的細胞凍存培養基。
細胞培養溫度的設定
1)細胞培養的*溫度主要取決于細胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。
2)與溫度過(guò)低相比，細胞培養時(shí)溫度過(guò)高時(shí)更為嚴重的問(wèn)題：因此，往往將培養箱的溫度設定為略低于*溫度。
各類(lèi)細胞培養的*溫度
1)大多數人和哺乳動(dòng)物細胞系在36℃~37℃下具有*生長(cháng)狀態(tài)。
2)昆蟲(chóng)細胞在27℃具有*生長(cháng)狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內，細胞生長(cháng)較慢。
3)溫度超過(guò)30℃時(shí)，昆蟲(chóng)細胞活力降低，即使溫度降至27℃，細胞活力也無(wú)法恢復。
4)禽類(lèi)細胞系在38.5℃時(shí)具有*生長(cháng)狀態(tài)。雖然此類(lèi)細胞也可在37℃下培養，但其生長(cháng)速度會(huì )變慢。
5)來(lái)源于冷血動(dòng)物（例如：兩棲動(dòng)物、冷水魚(yú)）的細胞系可耐受很寬的溫度范圍，為15-26℃。
6)請注意每種細胞的培養條件均有所不同，偏離某種細胞所需的培養條件會(huì )導致細胞表型異常，甚至培養*失敗。
細胞培養的zui適pH
1)大多數正常的哺乳動(dòng)物細胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長(cháng)良好，而且不同細胞株間差異極小。
2)但是，目前發(fā)現有些轉化細胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時(shí)生長(cháng)較好，而有些正常的成纖維細胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7。
3)Sf9和Sf21等昆蟲(chóng)細胞系在pH值為6.2的環(huán)境中生長(cháng)。
細胞培養基zui適pH的控制
1)細胞培養基可控制培養體系的pH值，為培養的細胞緩沖pH值的變化。這種緩沖作用通常是通過(guò)添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實(shí)現。
2)由于培養基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡，因此空氣中二氧化碳含量的變化會(huì )改變培養基的pH值。
3)為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養基時(shí)必須使用外源性二氧化碳，特別是使用開(kāi)放式培養皿培養細胞或者進(jìn)行高濃度的轉化細胞系培養時(shí)。
細胞培養中血清的保存
1)細胞培養中所用的血清不盡相同，您需要根據您所培養的細胞種類(lèi)和培養要求來(lái)挑選出的血清。建議將血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，請勿超過(guò)一個(gè)月。若無(wú)法一次用完一瓶，建議您將血清無(wú)菌分裝至合適體積的滅菌容器內，再放回冷凍箱保存。
2)解凍血清時(shí)，建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過(guò)夜融解，然后在室溫下使之全融。需要注意的是，融解過(guò)程中必須規則地搖晃均勻。
如何在細胞鋪板時(shí)避免“邊緣效應”
1)細胞實(shí)驗鋪板時(shí)，為避免“邊緣效應”，以應用96孔板的中間60孔為*，一般四周的一圈邊緣孔不養細胞，只做空白或陰性對照。
2)鋪板時(shí)，細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來(lái)而導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個(gè)就再混勻一下。
3)加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。此外，吹散次數過(guò)多也會(huì )影響細胞活力。所以要熟練操作，盡快上板。
何時(shí)選擇使用熱滅活血清
1)加熱血清可以滅活補體系統。
2)啟動(dòng)的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，啟動(dòng)淋巴細胞和巨噬細胞活化。
3)在免疫學(xué)研究、培養ES細胞、昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。
熱滅活血清可能出現的現象
1)在免疫學(xué)研究、培養ES細胞、昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。而對于其他大多數的細胞來(lái)說(shuō)是不需要熱滅活血清的。
2)熱滅活血清對細胞的生長(cháng)只有微小的促進(jìn)，或*沒(méi)有任何作用，甚至可能因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長(cháng)速率的降低；經(jīng)過(guò)熱處理的血清，沉淀物會(huì )顯著(zhù)地增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀(guān)察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì )讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37度環(huán)境中，又會(huì )使此沉淀物增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
3)根據自己的研究需要是否需要熱滅活血清。如此一來(lái)，不但能確保血清的質(zhì)量，而且能夠節省實(shí)驗時(shí)間。
如何正確熱滅活血清
1)熱滅活時(shí)請將血清置于56℃水浴30分鐘。
2)為盡量減少熱滅活對血清品質(zhì)的影響，一次滅活的血清體積不宜過(guò)大。

3)準備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時(shí)將裝有血清和水的容器同時(shí)放入56℃水浴，在裝水的容器中放置溫度計，加熱過(guò)程中不時(shí)地輕輕旋轉混勻血清，當溫度計顯示達到56℃左右，開(kāi)始計時(shí)。