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在制作原代細胞免疫熒光時(shí),容易出現一些問(wèn)題,造成熒光鑒定失敗,將抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體檢測組織或細胞內的相應抗原(或抗體)時(shí),一定要注意抗體的比例高低和濃度。
制作免疫熒光常用的方法有:
方法一:直接法
步驟:將熒光標記的特異性抗體(抗原)直接加在抗原(抗體)上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間染色,水洗—干燥—封片—鏡檢
優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性染色少
缺點(diǎn):敏感性低
方法二:間接法
步驟:先用已知未標記的特異性抗體(一抗)與抗原反應,再用標記的抗體(二抗)與其反應,形成抗原—抗體—抗體復合物,水洗—干燥—封片—鏡檢
優(yōu)點(diǎn):敏感性強,目前多采用間接法
缺點(diǎn):操作復雜
實(shí)驗過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題:
1,整個(gè)細胞片都出現熒光高點(diǎn)
原因有二:一是二抗濃度過(guò)高,適當降低二抗濃度即可。二是二抗發(fā)生沉淀,可以使用過(guò)濾或者離心熒光標記二抗
2,信號弱或無(wú)信號,染色細胞過(guò)少
目標蛋白在細胞中沒(méi)有表達,需要制備細胞裂解液,用Western Blotting驗證目標蛋白在細胞中是否表達。
表達目標蛋白的細胞過(guò)少,標本中使用更多的細胞,試用其他瞬時(shí)轉染方法,或者使用穩定轉染細胞系。
細胞通透性差,需要增加通透劑作用的時(shí)間或者濃度,或改用其它的通透劑
染色前的固定步驟破壞了抗原表位,改用其他固定方法。
通透使抗原丟失,可以減少通透劑作用的時(shí)間或強度。
抗體不識別,需要換用其他抗體
一抗稀釋度過(guò)大,使用同一樣品按*的二抗用量作一抗稀釋曲線(xiàn),以確定*的一抗稀釋比例。
二抗選擇錯誤,要使用正確的二抗
3,鏡下觀(guān)察只有DAPI的藍光,目的熒光幾乎沒(méi)有或者很弱
出現這種現象很有可能是抗體比例太低,需提高抗體濃度,可配合提高二抗濃度;共聚焦的激發(fā)熒光強度不夠大;二抗孵育時(shí)是否是對應的種屬,比如本來(lái)需要山羊抗鼠結果加為山羊抗兔。
4,細胞核周?chē)偸谴嬖谟幸恍┧{色的小點(diǎn)點(diǎn)
這種情況一般是支原體污染所致,建議用殺支原體藥2周后再檢測,或者通過(guò)提高共聚焦機器背景值來(lái)覆蓋支原體熒光
5,如何共定位的視野
共定位時(shí),首先判斷哪些細胞是轉染成功的,比如我過(guò)表達了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關(guān)系,則在視野中尋找已成功轉染蛋白A的細胞,一般熒光強度會(huì )顯著(zhù)高于周邊其他細胞,再在這個(gè)細胞上觀(guān)察蛋白B的表達。
6,視野中細胞與細胞之間存在散在的發(fā)光點(diǎn)
有兩種情況可造成:1,拍照時(shí)PBS量過(guò)少引起的非特異性;2,PBS未過(guò)濾,未溶解的殘渣黏附而導致
三、除此之外,這些注意事項也要牢記
1、合適的抗體稀釋比例
通過(guò)優(yōu)化抗體稀釋比例來(lái)優(yōu)化染色,通常情況下1ug/ml的純化抗體或者1:100-1:1000的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下,可以通過(guò)增加濃度來(lái)提高信號強度。如果是*次使用該抗體或測定某抗原,強烈建議濃度梯度實(shí)驗。
2、抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體,可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下,純化抗體的效果很好,但是正確的對照可以幫助定位抗原。使用只有二抗染色的片子
3、細胞固定和通透
為達到*的檢測效果,細胞需要經(jīng)過(guò)固定和通透。這些步驟非常關(guān)鍵,細胞和抗原需要保證*的結構,并利于抗體與抗原結合。通常情況下,需要通過(guò)以下步驟得以實(shí)現:細胞用2%-4%多聚甲醛固定,之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100進(jìn)行通透。前者是比較溫柔的處理,但是對于核內抗原可能無(wú)效,需要用到Triton。使用皂角苷進(jìn)行通透時(shí),要注意它會(huì )引起細胞膜的可逆性通透,也就是除了在通透初期,在每個(gè)抗體孵育環(huán)節都需要進(jìn)行通透。另外,細胞可以用冰甲醇進(jìn)行同時(shí)固定和通透,可以避免去垢劑的使用。
4、封閉條件的優(yōu)化選擇
為了防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前用封閉液封閉,這樣可以減少非特異性的背景著(zhù)色。封閉液可以選擇二抗來(lái)源一致的血清,一般來(lái)說(shuō),血清價(jià)格比較昂貴,可以用1%-5%BSA替代,BSA可以說(shuō)是的封閉血清。另外封閉時(shí)間不易過(guò)長(cháng),30-60min即可,且封閉后不用洗滌,直接加一抗孵育即可。
5、一抗二抗的選擇
封閉過(guò)后需要一抗孵育,可以選擇4度過(guò)夜孵育或者室溫3h,以筆者的經(jīng)驗是一抗孵育4度過(guò)夜比較好,抗原抗體結合會(huì )比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據抗體說(shuō)明書(shū)來(lái),再根據自己具體的實(shí)驗要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過(guò)低,會(huì )造成信號太弱,如果抗體濃度過(guò)高可能會(huì )造成背景染色太強。熒光二抗個(gè)人感覺(jué)Alex flour熒光基團信號強于Dylight強于FITC。如果做免疫雙標,一抗要來(lái)自不同種屬,熒光二抗的光譜也要分開(kāi)。
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