人臍靜脈細胞HUVEC的實(shí)驗步驟是怎樣的？　

　　人臍靜脈細胞HUVEC是從臍帶組織中分離出來(lái)的；它是臍帶的重要結構細胞之一，在人體的正常生理過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要作用。臍帶是連接哺乳動(dòng)物的胎兒和胎盤(pán)的管狀結構。臍帶中穿過(guò)尿道膜的血管是臍動(dòng)脈和臍靜脈，卵黃囊中的血管是臍腸系膜動(dòng)脈和臍腸系膜靜脈。在子宮內，來(lái)自胎盤(pán)母親部分的子宮動(dòng)脈的毛細血管與胎盤(pán)女兒部分的胎兒毛細血管接近，母親和胎兒的血液在這里進(jìn)行二氧化碳和氧氣的交換，代謝物是代謝廢物和營(yíng)養物質(zhì)。臍動(dòng)脈將胎兒產(chǎn)生的廢物輸送到胎盤(pán)，而臍靜脈將O2和營(yíng)養物質(zhì)從胎盤(pán)輸送到胎兒體內。

 

　　人臍靜脈細胞HUVEC是通過(guò)胰蛋白酶膠原酶聯(lián)合消化法結合差異化粘附法制備的，并在內皮細胞專(zhuān)用培養基中進(jìn)行了培養和篩選。細胞總數約為5×10^5個(gè)/瓶；細胞經(jīng)CD31/vWF免疫熒光鑒定，純度達90%以上，無(wú)HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
 

       人臍靜脈細胞HUVEC的實(shí)驗步驟

　　1、將15-20cm長(cháng)的新生兒臍帶放入無(wú)菌PBS溶液中保存。(注意：在4℃下最多可保存24小時(shí)，室溫下可保存6小時(shí)，否則將被丟棄）。

　　2、將鈍針插入臍靜脈管，用無(wú)菌PBS液沖洗3-5次，直至污染的血液干凈。

　　3、用手術(shù)鉗夾住臍帶下端，加入15ml膠原酶（1mg/ml）在室溫下消化15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u晃臍帶。

　　4、消化結束后，松開(kāi)下面的手術(shù)鉗，將消化液流入50ml無(wú)菌離心管，用無(wú)菌PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

　　5、將收集的溶液離心（2000rpm）3分鐘。

　　6、取出上清液，加入10mlM199培養基（加入10U/ml的bFGF），用肘部吹去細胞，將所有液體轉移到用明膠包裹的培養瓶中，在37℃下培養（注：每個(gè)培養瓶中加入3-4ml無(wú)菌1%明膠溶液，搖勻使明膠溶液*覆蓋瓶底，37℃下培養至少2小時(shí)。使用前倒掉明膠溶液。明膠涂層有利于細胞壁的粘附）。

　　7、培養24小時(shí)后，倒出培養基，用無(wú)菌PBS溶液洗2-3次，洗去紅細胞和死細胞，加入10ml新鮮M199培養基。

　　8、每2天更換一次培養基（每次更換2/3的培養基）。

　　9、一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)5-7天的培養，細胞可以生長(cháng)到80-90%的單層，可以傳代。

　　10、人臍靜脈細胞HUVEC倒出培養基，用無(wú)菌PBS溶液洗2-3次，加入2-3毫升消化液（0.25%胰蛋白酶+0.1%EDTA）消化細胞，在顯微鏡下觀(guān)察。一旦細胞變圓，加入2-3次含血清的DMEM培養基以停止反應。

　　11、用肘部吹干細胞，將消化后的細胞轉移到50ml無(wú)菌離心管中，2000rpm，離心3分鐘。

　　12、倒出上清液，加入10毫升新鮮培養基。一般來(lái)說(shuō)，3-4瓶細胞可以在一個(gè)瓶子里進(jìn)行傳代培養，然后像這樣進(jìn)行傳代培養。

　　13、一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)2-3代（約20天）進(jìn)行各種實(shí)驗。